严敏, 李崎, 顾国贤
                （江南大学教育部工业生物技术重点实验室，江苏无锡214036）
摘   要：利用自旋捕集技术，采用电子自旋共振（ESR） 仪研究了啤酒经保温产生自由基以及啤酒清除二苯代苦味酰肼自由基（DPPH） 的过程，结果表明：啤酒具有产生和清除自由基的双重性质，探讨了啤酒酿造及贮存过程中易于形成自由基和发生自由基链反应的工艺阶段，以及清除自由基的物质及来源。
关 键 词：啤酒；自由基；电子自旋共振（ESR）；PBN；DPPH
中图分类号：TS262.5 文献标识码：B  文章编号：0254- 5071（2006） 02-0024-03
    啤酒是一个非常复杂的体系，目前已知含有800多种有机和无机化合物，这个复杂的体系中的一些物质形成了啤酒特有的主体风味，而另一些物质又通过一系列物理化学反应来改变这种风味，使得啤酒的风味处在不断的变化中，并最终导致风味老化。尽管啤酒老化的机理尚未完全阐明，但氧化反应应该是老化风味产生的最重要原因。风味稳定期可以认为是各种力量均衡的维持期，当氧化反应占主导后风味即开始趋向于老化。近来的研究表明，氧自由基（·O2-、·OH、1O2、H2O2、RO·、ROO·、ROOH） 参与了啤酒的氧化。
    电子自旋共振法（Electron Spin Resonance，简称ESR） 是惟一可以定量测定自由基的方法，但由于一
般的自由基存在时间非常短，所以直至自旋捕集技术的出现，才开始应用于短寿命自由基，如氧自由基的
测定。其原理是利用自旋捕集剂与自由基反应生成相对稳定的加合物，再对加合物进行测定，对氧自由基
而言较常用的自旋捕集剂是2- 苯叔丁基硝酮（N-tbutyl-α-phenylnitrone，简称PBN）。另一方面，二苯
代苦味酰肼自由基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，简称DPPH） 是一种相对较稳定的自由基，当有自由基清除剂存在时，DPPH 的单电子被分配而使ESR信号减弱，从而评价样品的抗氧化能力。

1 材料与方法
1.1 主要试剂
    啤酒：市售商品啤酒；PBN （纯度98%）、DPPH（纯度90%）：SIGMA公司。
1.2 主要仪器
    电子自旋共振仪：德国BRUKER 公司。
1.3 测定方法
    自由基捕集实验：将0.5mL 除气啤酒装入离心管，外覆铝箔避光，加入PBN 溶液（50%乙醇- 水）使其终浓度达到0.02mol/L，混匀；置于60℃水浴中，促使自由基产生，于270min 时取样测定。ESR 测定条件：中心磁场3475.00G；微波功率4mW；微波频率9.7GHz；调制频率200kHz；调制幅度2.00G；室温；扫描时间3min。
    自由基清除实验：将2.0mL 除气啤酒及2 mL的DPPH 乙醇溶液置于具塞试管中，DPPH 乙醇溶液终浓度为0.05mmo/L，摇匀，0℃静置30min，进行ESR 测定。

2 结果与讨论
2.1 啤酒自由基的产生
啤酒中PBN自旋加合物ESR谱见图1。

    从图1可以看出，在磁场3453.8368G处开始出现自由基信号，至3493.5239G处信号终止，其超精细分裂常数（hfs） αN、αH分别是15.6G和3.0G，结合特征性分岔谱线基本可以认为该自旋加合物是PBN-OH，这表明在啤酒氧化过程中产生了·OH自由基。
    辐射、热和氧化还原反应是产生自由基的适宜条件，啤酒酿造及贮存过程均涉及这些方面。
    制麦：麦芽作为啤酒最主要的原料，是啤酒风味物质及前体物质最主要的来源，随制麦过程进行, 温
度升高超过50℃时美拉德反应被激活，产生类黑色素自由基，可作为中介使醇类氧化。
    糖化煮沸是继制麦后又一个温度较高的过程，高温引发自由基一方面能与基质反应生成老化（前驱）
物质，另一方面能够破坏麦芽中酶类，如β-葡聚糖酶，即使在糖化过程中以低温保持酶活，高浓度的自
由基也能产生极大的危害。
    发酵过程中代谢非常旺盛，风味物质大量形成，由于前期的供氧，使得发酵液中存有超氧自由基及后
续的·OH，这些自由基活性很强，作为反应中介传递自由基，加速氧化还原链向下传递。
    过滤及巴氏灭菌： 由硅藻土带入的铁离子是fenton反应的催化剂。
     Fe2+ + H2O2 →Fe3+ +·OH + OH-
     Fe3+ + H2O2→Fe + O2- + 2H+
     H2O2→OH + OH- + O2- + 2H+
    一般熟啤采用高温瞬时20 P.U.巴氏灭菌， 会大大加快fenton反应，使酒液中出现大量氧自由基，引发
链式反应。
    贮存：外界条件相对稳定，但酒液中仍有相当复杂的反应，使得啤酒的风味处于不断变化之中，这一阶段的主要反应有：不饱和脂肪酸的酶氧化及自由基氧化可以导致大量挥发性醛的形成；强烈的阳光和紫外线使不饱和脂肪酸、异葎草酮光氧化，啤酒中的核黄素及其衍生物、类黑色素均是光的活性体。以这些光活性体为中介，不饱和脂肪酸分解成为具有风味活性的羰基化合物；以类黑色素为中介的醇氧化。
    总之，啤酒酿造及贮存过程中伴随大量自由基生成和反应，同时促进了啤酒老化风味的形成。
2.2 清除啤酒DPPH自由基
    在DPPH溶液中添加啤酒前后的ESR谱见图2。
    从图2可以看出，DPPH自由基的ESR谱是典型的五线谱以中间谱线的峰高代表信号强弱。添加啤酒后，DPPH自由基信号明显减弱，说明啤酒对DPPH自由基有清除作用。这种清除作用来源于啤酒中的内、外源抗氧化剂。啤酒中含有大量的抗氧化物质，包括多酚如阿魏酸、香豆酸、儿茶素、花色素以及类黑精、含硫化合物等，这些物质主要来源于原料和酵母代谢。
    麦芽中有很多抗氧化物质，如大麦中的多酚，制麦和焙焦时产生的部分美拉德产物，经酿造过程存在于成品中。提高焙焦温度有利于麦芽多酚在糖化时的溶出；深色麦芽的抗氧化物质含量高于浅色麦芽。
    酒花除赋予啤酒特殊的香气外，还带入多酚物质（主要是单体酚和单体多酚）。
    发酵前期酵母暴露于氧气中会合成超氧化物歧化酶和过氧化氢酶，从而激发对自由基破坏的保护；同时代谢产生的含硫化合物（主要是SO2） 提高酒液的还原力，并有效遮盖老化醛的劣味。
    多酚、类黑精、SO2都具有两面性，一方面有抗氧化的作用，另一方面又会对啤酒造成负面影响。比
如多酚易形成混浊，类黑精加深啤酒色度，过量SO₂会有硫臭味。

3 小结
    啤酒是一个复杂的溶液，一些物质促进了自由基的形成，另一些物质又有清除自由基的能力，物质间不停的作用导致啤酒风味的动态变化。自由基反应贯穿啤酒生产及贮存的整个过程，对老化风味的形成有极大的推动作用，减少生产及贮存过程中自由基的量，在不影响风味的前提下适当提高可清除自由基的物质含量，对提高啤酒风味稳定性非常有益。